摘要：本研究針對術后神經認知障礙(PNCI)缺乏有效靶向治療的問題，開展了關于海馬區(qū)膠質細胞異質性及網絡通訊機制的單細胞測序研究。
隨著全球人口老齡化和外科技術的發(fā)展，接受手術治療的老年患者日益增多。然而，手術創(chuàng)傷和麻醉等因素使這一人群易患術后神經認知障礙(PNCI)，這種并發(fā)癥嚴重影響患者康復進程和生活質量。盡管PNCI具有重要的臨床意義，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的靶向治療方法。海馬體作為學習和記憶的關鍵腦區(qū)，已被廣泛證實與術后認知功能障礙密切相關。
研究表明，中樞神經系統(tǒng)(CNS)炎癥是PNCI發(fā)生發(fā)展的關鍵致病驅動因素。作為CNS的常駐免疫細胞，小膠質細胞在調節(jié)圍手術期炎癥和維持內環(huán)境穩(wěn)定中起著至關重要的作用。然而，圍手術期小膠質細胞在PNCI發(fā)生發(fā)展中的貢獻、表型異質性和通訊網絡仍特征不足。傳統(tǒng)上將小膠質細胞簡單分為M1(神經毒性和促炎)和M2(神經保護和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小膠質細胞表型異質性的復雜性。在阿爾茨海默病(AD)模型中，特定小膠質細胞亞群——疾病相關小膠質細胞(DAM)的特征已被描述，但在圍手術期海馬中小膠質細胞特定亞群的作用及其激活過程中的表型異質性仍知之甚少。
圖1 炎癥相關的小膠質細胞擴增會破壞海馬區(qū)膠質細胞網絡的通信，進而引發(fā)術后神經認知功能障礙
為了解決這些知識空白，鄭玉祥等研究人員在《Journal of Neuroinflammation》上發(fā)表了題為"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究論文。該研究通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術，系統(tǒng)描繪了PNCI小鼠海馬區(qū)膠質和血管細胞的全景圖譜，特別聚焦于小膠質細胞的異質性及其細胞間通訊網絡。
研究人員為開展本研究主要采用了以下幾個關鍵技術方法：使用18月齡老年小鼠建立PNCI模型并開展行為學測試；對對照組和手術組小鼠海馬組織進行單細胞RNA測序分析；通過免疫熒光結合熒光原位雜交(IF/FISH)驗證亞群數量和靶RNA轉錄本表達；利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構；采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測海馬TNF-α水平；通過Morris水迷宮和恐懼條件測試評估認知功能；應用TNF抑制劑依那西普進行干預研究。
研究人員對術后24小時的小鼠海馬組織進行scRNA-seq分析，共獲得20,684個海馬細胞，鑒定出10種細胞群，包括小膠質細胞、星形膠質細胞、內皮細胞(ECs)、神經元等。聚焦于血腦屏障損傷、CNS炎癥和內環(huán)境穩(wěn)定中具有重要生物學功能的兩種膠質細胞群和一種血管細胞群：小膠質細胞(標記基因C1qc，對照組3,814個細胞，手術組4,776個細胞)、星形膠質細胞(標記基因Aqp4，對照組1,183個細胞，手術組1,072個細胞)和內皮細胞(標記基因Flt1，對照組150個細胞，手術組236個細胞)。
對8,590個海馬小膠質細胞進行二次聚類分析，鑒定出八個轉錄不同的亞群：穩(wěn)態(tài)小膠質細胞(HM，占42%)、過渡狀態(tài)小膠質細胞(TSM，占27%，表達即刻早期基因IEGs和炎癥基因)、炎癥相關小膠質細胞(IAM，占12%，表達大量炎癥相關基因)、疾病相關小膠質細胞(DAM，占6%)以及三個具有抗炎和神經保護基因表達模式的亞群：炎癥抑制性小膠質細胞(IIM，占6%)、代謝相關抑制性小膠質細胞(MIM，占2%)和疾病相關抑制性小膠質細胞(DIM，占1%)，其余4%為巨噬細胞。
手術組與對照組相比，小膠質細胞亞群發(fā)生顯著變化：HM從術前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM從1.4%增至47.8%(增加超過33倍)；IAM從1.3%增至21%(增加超過14倍)。這些發(fā)現表明手術后海馬小膠質細胞穩(wěn)態(tài)被深刻破壞，向過渡狀態(tài)和炎癥相關激活狀態(tài)轉變。
偽時間分析顯示，小膠質細胞從HM開始，通過以即刻早期基因表達為特征的中間轉錄狀態(tài)(TSM)，隨后分化為兩個不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表達模式?；蚬脖磉_網絡分析確定了HM、TSM、IAM和IIM這些亞群功能的關鍵調控基因。
基于圍手術期小膠質細胞亞群的變化，建立了小膠質細胞激活相關信號通路。在IAM中，Tnf及其受體Tnfrsf1a均上調。促炎細胞因子Il1b通過TNF和NF-κB通路上調，導致促炎反應。Ccl2和Tspo在IAM中上調，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH雙染證實手術組海馬中Tnf+IBA1+細胞(IAM)顯著增加。作為IAM的炎癥標記基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的熒光強度在手術組海馬小膠質細胞中顯著升高。作為IAM的趨化因子和線粒體標記基因，Ccl2和Tspo mRNA的熒光強度也在海馬小膠質細胞中升高。
聚類分析鑒定出六個不同的星形膠質細胞亞群：穩(wěn)態(tài)星形膠質細胞(HA，占36%)、血管生成相關星形膠質細胞(AAA，占3%)、代謝相關星形膠質細胞(MAA，占4%)、疾病和代謝相關星形膠質細胞(DMA，占32%)、疾病相關抑制性星形膠質細胞(DIA，占9%)和代謝相關抑制性星形膠質細胞(MIA，占16%)。與微膠質細胞相比，圍手術期星形膠質細胞的變化不太明顯：手術組HA從術前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA從14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亞群變化更不顯著。
CellChat分析顯示，手術后細胞間通訊增加，小膠質細胞到小膠質細胞、星形膠質細胞到星形膠質細胞以及星形膠質細胞到小膠質細胞的信號顯著增強。在小膠質細胞亞群中，IAM和TSM表現出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(IAM=91，TSM=85)和相互作用強度(均為2.7)。在星形膠質細胞亞群中，HA和MAA表現出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(HA=135，MAA=111)和強度(HA=4.4，MAA=4.6)。隨后的IAM亞群分析顯示，在所有差異通路中，TNF信號在傳入和傳出相互作用強度方面增加最大。
對微膠質細胞中上調的主要信號通路進一步分析發(fā)現，在TNF信號通路中，手術后IAM成為TNF信號的主要調節(jié)因子，作為TNF配體的主要來源、TNF相關信號的主要接收者和信號傳播中的關鍵中介。Tnf-Tnfrsf1a配體-受體(L-R)對通訊在手術組IAM中顯著增加。在BAFF通路中，手術后IAM通過同時產生BAFF配體、響應BAFF相關線索和參與微膠質網絡中的信號中繼顯示出增強的參與。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成為星形膠質細胞源性CHEMERIN信號的主要接收者。在APP通路中，內皮細胞作為APP相關信號的主要來源，主要靶向DIM。
基于已識別的微膠質細胞亞群和細胞間通訊模式，建立了假設的調節(jié)網絡，顯示IAM通過升高的TNF信號在啟動炎癥中起關鍵作用，從而影響星形膠質細胞反應和內皮功能障礙。透射電子顯微鏡顯示手術后海馬血管超微結構變化：內皮細胞出現明顯的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明內皮屏障損傷。
選擇臨床可用的TNF抑制劑依那西普(etanercept)靶向IAM驅動的炎癥。ELISA證實海馬TNF-α水平在手術組顯著增加，依那西普治療后有效抑制。IF/FISH驗證了調節(jié)網絡主要功能基因的表達：炎癥基因Tnf、Ccl2和Il1b在手術組海馬小膠質細胞中顯著上調，而TNF抑制劑將其表達降低至基線水平。免疫熒光證實TNF-α蛋白表達也在手術組小膠質細胞中增加，TNF抑制劑將其表達降低至基線。Egr1和C1qa在星形膠質細胞中顯著上調，Icam1和Iftm3在手術組血管內皮細胞中顯著上調，TNF抑制劑將其表達降低至基線。
通過Morris水迷宮(MWM)和恐懼條件測試(FCT)評估老年小鼠手術后和TNF抑制后的認知功能。在MWM測試中，逃避潛伏期在對照組隨著訓練進行顯著減少，這種趨勢在手術組不太明顯，TNF抑制劑治療可挽救這種缺陷?？臻g記憶通過平臺穿越次數和在目標象限停留時間評估，手術后受損，TNF抑制劑治療可挽救。在FCT中，海馬依賴的情景記憶在手術后1天和5天顯著受損，TNF抑制劑治療挽救了這些情境認知障礙。對于海馬非依賴的語調認知，兩組方差分析顯示治療(依那西普vs鹽水)和條件(對照vs手術)之間沒有顯著交互作用。
圖2 對照組和手術組小鼠的海馬體均于術后24小時提取，用于單細胞RNA測序分析
本研究提供了PNCI小鼠海馬膠質和血管細胞群的單細胞圖譜，揭示了八個微膠質細胞亞群。其中，擴增的IAM表現出與膠質細胞和內皮細胞增強的網絡通訊，通過TNF介導的信號傳導促進海馬炎癥。此外，TNF抑制減輕了術后微膠質細胞激活和認知障礙。這些發(fā)現突出了海馬IAM作為PNCI預防和治療的關鍵致病驅動因素和有前景的治療靶點。
該研究的創(chuàng)新之處在于首次在圍手術期背景下系統(tǒng)描繪了海馬區(qū)微膠質細胞的異質性圖譜，特別是發(fā)現了IAM這一關鍵亞群在PNCI中的核心作用。不同于神經退行性疾病中觀察到的慢性激活，圍手術期微膠質細胞激活是短暫而強烈的，術后24小時即觀察到IAM增加。這種急性微膠質細胞激活可能啟動長期的神經炎癥和進行性神經元功能障礙，導致長期認知障礙。
研究還揭示了微膠質細胞、星形膠質細胞和內皮細胞共同構成膠質血管單元(GVU)，在神經退行性疾病進展中調節(jié)血腦屏障功能和CNS穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。在GVU內，微膠質細胞和星形膠質細胞與腦血管保持密切的空間接近。研究表明，術后IAM的擴增與星形膠質細胞和內皮細胞的通訊增強相關。IAM誘導反應性星形膠質細胞表型，進一步塑造炎癥微環(huán)境。微膠質細胞和星形膠質細胞之間的雙向相互作用，以及內皮功能障礙，形成維持神經炎癥的病理循環(huán)。
該研究為PNCI的防治提供了新的思路和靶點?？刂莆⒛z質細胞激活和減輕CNS炎癥已被確定為AD、缺血性中風和創(chuàng)傷性腦損傷的有前景的治療策略。研究表明，靶向IAM通過TNF信號干預具有治療潛力。臨床試驗也顯示TNF抑制劑在AD患者中的安全性、耐受性和潛在認知益處。然而，這種干預仍然是超適應癥使用，TNF抑制劑在PNCI和神經退行性疾病患者中的使用仍需進一步研究。
總之，這項研究不僅深化了對PNCI發(fā)病機制的理解，而且為開發(fā)針對特定微膠質細胞亞群的精準治療策略提供了重要依據，具有重要的理論意義和臨床轉化價值。
參考資料
[1] Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment
摘要：本研究針對術后神經認知障礙(PNCI)缺乏有效靶向治療的問題，開展了關于海馬區(qū)膠質細胞異質性及網絡通訊機制的單細胞測序研究。
隨著全球人口老齡化和外科技術的發(fā)展，接受手術治療的老年患者日益增多。然而，手術創(chuàng)傷和麻醉等因素使這一人群易患術后神經認知障礙(PNCI)，這種并發(fā)癥嚴重影響患者康復進程和生活質量。盡管PNCI具有重要的臨床意義，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的靶向治療方法。海馬體作為學習和記憶的關鍵腦區(qū)，已被廣泛證實與術后認知功能障礙密切相關。
研究表明，中樞神經系統(tǒng)(CNS)炎癥是PNCI發(fā)生發(fā)展的關鍵致病驅動因素。作為CNS的常駐免疫細胞，小膠質細胞在調節(jié)圍手術期炎癥和維持內環(huán)境穩(wěn)定中起著至關重要的作用。然而，圍手術期小膠質細胞在PNCI發(fā)生發(fā)展中的貢獻、表型異質性和通訊網絡仍特征不足。傳統(tǒng)上將小膠質細胞簡單分為M1(神經毒性和促炎)和M2(神經保護和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小膠質細胞表型異質性的復雜性。在阿爾茨海默病(AD)模型中，特定小膠質細胞亞群——疾病相關小膠質細胞(DAM)的特征已被描述，但在圍手術期海馬中小膠質細胞特定亞群的作用及其激活過程中的表型異質性仍知之甚少。
圖1 炎癥相關的小膠質細胞擴增會破壞海馬區(qū)膠質細胞網絡的通信，進而引發(fā)術后神經認知功能障礙
為了解決這些知識空白，鄭玉祥等研究人員在《Journal of Neuroinflammation》上發(fā)表了題為"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究論文。該研究通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術，系統(tǒng)描繪了PNCI小鼠海馬區(qū)膠質和血管細胞的全景圖譜，特別聚焦于小膠質細胞的異質性及其細胞間通訊網絡。
研究人員為開展本研究主要采用了以下幾個關鍵技術方法：使用18月齡老年小鼠建立PNCI模型并開展行為學測試；對對照組和手術組小鼠海馬組織進行單細胞RNA測序分析；通過免疫熒光結合熒光原位雜交(IF/FISH)驗證亞群數量和靶RNA轉錄本表達；利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構；采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測海馬TNF-α水平；通過Morris水迷宮和恐懼條件測試評估認知功能；應用TNF抑制劑依那西普進行干預研究。
研究人員對術后24小時的小鼠海馬組織進行scRNA-seq分析，共獲得20,684個海馬細胞，鑒定出10種細胞群，包括小膠質細胞、星形膠質細胞、內皮細胞(ECs)、神經元等。聚焦于血腦屏障損傷、CNS炎癥和內環(huán)境穩(wěn)定中具有重要生物學功能的兩種膠質細胞群和一種血管細胞群：小膠質細胞(標記基因C1qc，對照組3,814個細胞，手術組4,776個細胞)、星形膠質細胞(標記基因Aqp4，對照組1,183個細胞，手術組1,072個細胞)和內皮細胞(標記基因Flt1，對照組150個細胞，手術組236個細胞)。
對8,590個海馬小膠質細胞進行二次聚類分析，鑒定出八個轉錄不同的亞群：穩(wěn)態(tài)小膠質細胞(HM，占42%)、過渡狀態(tài)小膠質細胞(TSM，占27%，表達即刻早期基因IEGs和炎癥基因)、炎癥相關小膠質細胞(IAM，占12%，表達大量炎癥相關基因)、疾病相關小膠質細胞(DAM，占6%)以及三個具有抗炎和神經保護基因表達模式的亞群：炎癥抑制性小膠質細胞(IIM，占6%)、代謝相關抑制性小膠質細胞(MIM，占2%)和疾病相關抑制性小膠質細胞(DIM，占1%)，其余4%為巨噬細胞。
手術組與對照組相比，小膠質細胞亞群發(fā)生顯著變化：HM從術前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM從1.4%增至47.8%(增加超過33倍)；IAM從1.3%增至21%(增加超過14倍)。這些發(fā)現表明手術后海馬小膠質細胞穩(wěn)態(tài)被深刻破壞，向過渡狀態(tài)和炎癥相關激活狀態(tài)轉變。
偽時間分析顯示，小膠質細胞從HM開始，通過以即刻早期基因表達為特征的中間轉錄狀態(tài)(TSM)，隨后分化為兩個不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表達模式。基因共表達網絡分析確定了HM、TSM、IAM和IIM這些亞群功能的關鍵調控基因。
基于圍手術期小膠質細胞亞群的變化，建立了小膠質細胞激活相關信號通路。在IAM中，Tnf及其受體Tnfrsf1a均上調。促炎細胞因子Il1b通過TNF和NF-κB通路上調，導致促炎反應。Ccl2和Tspo在IAM中上調，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH雙染證實手術組海馬中Tnf+IBA1+細胞(IAM)顯著增加。作為IAM的炎癥標記基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的熒光強度在手術組海馬小膠質細胞中顯著升高。作為IAM的趨化因子和線粒體標記基因，Ccl2和Tspo mRNA的熒光強度也在海馬小膠質細胞中升高。
聚類分析鑒定出六個不同的星形膠質細胞亞群：穩(wěn)態(tài)星形膠質細胞(HA，占36%)、血管生成相關星形膠質細胞(AAA，占3%)、代謝相關星形膠質細胞(MAA，占4%)、疾病和代謝相關星形膠質細胞(DMA，占32%)、疾病相關抑制性星形膠質細胞(DIA，占9%)和代謝相關抑制性星形膠質細胞(MIA，占16%)。與微膠質細胞相比，圍手術期星形膠質細胞的變化不太明顯：手術組HA從術前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA從14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亞群變化更不顯著。
CellChat分析顯示，手術后細胞間通訊增加，小膠質細胞到小膠質細胞、星形膠質細胞到星形膠質細胞以及星形膠質細胞到小膠質細胞的信號顯著增強。在小膠質細胞亞群中，IAM和TSM表現出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(IAM=91，TSM=85)和相互作用強度(均為2.7)。在星形膠質細胞亞群中，HA和MAA表現出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(HA=135，MAA=111)和強度(HA=4.4，MAA=4.6)。隨后的IAM亞群分析顯示，在所有差異通路中，TNF信號在傳入和傳出相互作用強度方面增加最大。
對微膠質細胞中上調的主要信號通路進一步分析發(fā)現，在TNF信號通路中，手術后IAM成為TNF信號的主要調節(jié)因子，作為TNF配體的主要來源、TNF相關信號的主要接收者和信號傳播中的關鍵中介。Tnf-Tnfrsf1a配體-受體(L-R)對通訊在手術組IAM中顯著增加。在BAFF通路中，手術后IAM通過同時產生BAFF配體、響應BAFF相關線索和參與微膠質網絡中的信號中繼顯示出增強的參與。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成為星形膠質細胞源性CHEMERIN信號的主要接收者。在APP通路中，內皮細胞作為APP相關信號的主要來源，主要靶向DIM。
基于已識別的微膠質細胞亞群和細胞間通訊模式，建立了假設的調節(jié)網絡，顯示IAM通過升高的TNF信號在啟動炎癥中起關鍵作用，從而影響星形膠質細胞反應和內皮功能障礙。透射電子顯微鏡顯示手術后海馬血管超微結構變化：內皮細胞出現明顯的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明內皮屏障損傷。
選擇臨床可用的TNF抑制劑依那西普(etanercept)靶向IAM驅動的炎癥。ELISA證實海馬TNF-α水平在手術組顯著增加，依那西普治療后有效抑制。IF/FISH驗證了調節(jié)網絡主要功能基因的表達：炎癥基因Tnf、Ccl2和Il1b在手術組海馬小膠質細胞中顯著上調，而TNF抑制劑將其表達降低至基線水平。免疫熒光證實TNF-α蛋白表達也在手術組小膠質細胞中增加，TNF抑制劑將其表達降低至基線。Egr1和C1qa在星形膠質細胞中顯著上調，Icam1和Iftm3在手術組血管內皮細胞中顯著上調，TNF抑制劑將其表達降低至基線。
通過Morris水迷宮(MWM)和恐懼條件測試(FCT)評估老年小鼠手術后和TNF抑制后的認知功能。在MWM測試中，逃避潛伏期在對照組隨著訓練進行顯著減少，這種趨勢在手術組不太明顯，TNF抑制劑治療可挽救這種缺陷?？臻g記憶通過平臺穿越次數和在目標象限停留時間評估，手術后受損，TNF抑制劑治療可挽救。在FCT中，海馬依賴的情景記憶在手術后1天和5天顯著受損，TNF抑制劑治療挽救了這些情境認知障礙。對于海馬非依賴的語調認知，兩組方差分析顯示治療(依那西普vs鹽水)和條件(對照vs手術)之間沒有顯著交互作用。
圖2 對照組和手術組小鼠的海馬體均于術后24小時提取，用于單細胞RNA測序分析
本研究提供了PNCI小鼠海馬膠質和血管細胞群的單細胞圖譜，揭示了八個微膠質細胞亞群。其中，擴增的IAM表現出與膠質細胞和內皮細胞增強的網絡通訊，通過TNF介導的信號傳導促進海馬炎癥。此外，TNF抑制減輕了術后微膠質細胞激活和認知障礙。這些發(fā)現突出了海馬IAM作為PNCI預防和治療的關鍵致病驅動因素和有前景的治療靶點。
該研究的創(chuàng)新之處在于首次在圍手術期背景下系統(tǒng)描繪了海馬區(qū)微膠質細胞的異質性圖譜，特別是發(fā)現了IAM這一關鍵亞群在PNCI中的核心作用。不同于神經退行性疾病中觀察到的慢性激活，圍手術期微膠質細胞激活是短暫而強烈的，術后24小時即觀察到IAM增加。這種急性微膠質細胞激活可能啟動長期的神經炎癥和進行性神經元功能障礙，導致長期認知障礙。
研究還揭示了微膠質細胞、星形膠質細胞和內皮細胞共同構成膠質血管單元(GVU)，在神經退行性疾病進展中調節(jié)血腦屏障功能和CNS穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。在GVU內，微膠質細胞和星形膠質細胞與腦血管保持密切的空間接近。研究表明，術后IAM的擴增與星形膠質細胞和內皮細胞的通訊增強相關。IAM誘導反應性星形膠質細胞表型，進一步塑造炎癥微環(huán)境。微膠質細胞和星形膠質細胞之間的雙向相互作用，以及內皮功能障礙，形成維持神經炎癥的病理循環(huán)。
該研究為PNCI的防治提供了新的思路和靶點。控制微膠質細胞激活和減輕CNS炎癥已被確定為AD、缺血性中風和創(chuàng)傷性腦損傷的有前景的治療策略。研究表明，靶向IAM通過TNF信號干預具有治療潛力。臨床試驗也顯示TNF抑制劑在AD患者中的安全性、耐受性和潛在認知益處。然而，這種干預仍然是超適應癥使用，TNF抑制劑在PNCI和神經退行性疾病患者中的使用仍需進一步研究。
總之，這項研究不僅深化了對PNCI發(fā)病機制的理解，而且為開發(fā)針對特定微膠質細胞亞群的精準治療策略提供了重要依據，具有重要的理論意義和臨床轉化價值。
參考資料
[1] Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment
