摘要：研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4強化糖酵解并驅(qū)動腫瘤惡性進展。
胰腺癌作為消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，其五年生存率始終徘徊在10%左右，被稱為"癌中之王"。這種嚴峻的預后與腫瘤特有的缺氧微環(huán)境密切相關。在胰腺癌組織中，氧分壓可低至0-5.3 mmHg，遠低于正常組織的9.3-92.7 mmHg。這種極度缺氧的狀態(tài)不僅幫助腫瘤細胞適應惡劣環(huán)境，還驅(qū)動了一系列惡性生物學行為，成為胰腺癌預后不良的獨立預測因素。
在缺氧微環(huán)境中，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一類新型閉合環(huán)狀分子，通過反向剪接形成，其生物發(fā)生和功能與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關。研究表明，缺氧能誘導腫瘤細胞產(chǎn)生多種circRNA，這些分子幫助腫瘤細胞在缺氧條件下維持生存并促進腫瘤進展。然而，在胰腺癌中，缺氧相關circRNA編碼的蛋白質(zhì)功能仍不清楚。
研究人員將目光聚焦于PFKFB4基因——一個在糖代謝中發(fā)揮關鍵作用的酶。PFKFB4作為糖酵解分流酶，在果糖-2,6-二磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化中起核心作用，滿足腫瘤細胞的能量需求和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而促進腫瘤細胞在缺氧環(huán)境中的生存?；诖耍芯繄F隊提出科學假設：源自PFKFB4基因的circRNA可能是驅(qū)動胰腺癌細胞適應缺氧微環(huán)境并持續(xù)惡性演進的關鍵分子。
為驗證這一假設，研究人員采用缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)篩選胰腺癌中缺氧響應的circRNA，通過生物信息學分析和RNA免疫沉淀研究hsa_circ_0065394的環(huán)化機制，利用qRT-PCR和原位雜交評估其在胰腺癌中的表達譜和臨床意義。雙熒光素酶報告基因檢測、質(zhì)譜分析和Western blotting鑒定出hsa_circ_0065394編碼的蛋白cPFKFB4。通過功能獲得和缺失實驗在體內(nèi)外驗證cPFKFB4的生物學功能。從機制上，通過質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、免疫熒光、PKM剪接檢測、RNA免疫沉淀、Western blotting和挽救實驗，探索cPFKFB4如何調(diào)節(jié)hnRNP G與hnRNP A1的相互作用以及PKM選擇性剪接的調(diào)控。
研究發(fā)現(xiàn)缺氧相關的hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中顯著上調(diào)，且與腫瘤大小密切相關。其生物環(huán)化由hnRNP L和Alu重復序列介導。機制上，hsa_circ_0065394通過非帽依賴機制編碼一個94個氨基酸的蛋白cPFKFB4。cPFKFB4通過特異性結(jié)合hnRNP G破壞hnRNP G-hnRNP A1復合物，促進hnRNP A1介導的PKM選擇性剪接，從而增加PKM2的表達，進而增強胰腺癌細胞的糖酵解，加速缺氧條件下胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。
圖1 由hsa_circ_0065394編碼的新型蛋白cPFKFB4通過增強PKM2介導的葡萄糖代謝重編程，促進胰腺癌在缺氧條件下的進展
關鍵技術方法
研究采用臨床樣本隊列（44對胰腺癌及癌旁組織）和腫瘤組織芯片（70例胰腺癌和58例正常組織），通過缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)（1% O2）模擬腫瘤微環(huán)境。利用RNA酶R和放線菌素D實驗驗證circRNA特性，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測IRES活性，質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用，體內(nèi)外功能實驗包括CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤等評估生物學表型，PKM剪接實驗和代謝檢測分析分子機制。
hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細胞中的鑒定與表征
研究人員首先在缺氧條件下篩選PFKFB4來源的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細胞中表達最顯著。Sanger測序證實該circRNA是由PFKFB4基因外顯子2、3、4通過頭尾剪接形成的281nt環(huán)狀RNA。
實驗證實hsa_circ_0065394對RNA酶R具有抗性，且半衰期長于線性mRNA，在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，表明其是缺氧胰腺癌細胞中豐富且穩(wěn)定表達的circRNA。
hsa_circ_0065394的生物發(fā)生機制
通過生物信息學分析，研究人員在hsa_circ_0065394側(cè)翼內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了高反向互補性的Alu重復序列（AluYc和AluSx1）。缺失突變實驗證明只有同時存在這兩個Alu元件才能顯著上調(diào)hsa_circ_0065394表達。進一步篩選發(fā)現(xiàn)hnRNP L是hsa_circ_0065394生物發(fā)生的關鍵調(diào)控因子。RNA免疫沉淀實驗證實hnRNP L結(jié)合到PFKFB4前體mRNA的特定位點，促進側(cè)翼內(nèi)含子互補重復元件的結(jié)合，從而加速hsa_circ_0065394的環(huán)化。
hsa_circ_0065394的表達特征與臨床意義
在胰腺癌細胞系中，hsa_circ_0065394表達顯著上調(diào)，尤其在PANC-1和PL45細胞中。臨床樣本分析顯示其在胰腺癌組織中明顯高表達，且與腫瘤大小顯著相關。
組織芯片和原位雜交結(jié)果進一步驗證了hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中的高表達。生存分析顯示高表達患者總生存期更差，表明其具有重要的臨床預后價值。
hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4
生物信息學預測發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394包含一個285nt的開放閱讀框（ORF）和內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）。實驗證實該circRNA可翻譯產(chǎn)生約25kDa的蛋白，命名為cPFKFB4。
雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明IRES序列具有啟動翻譯活性，且完整的IRES序列對cPFKFB4的翻譯至關重要。
cPFKFB4通過hnRNP G調(diào)控PKM選擇性剪接
質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)cPFKFB4與hnRNP G特異性相互作用。進一步實驗確定cPFKFB4結(jié)合hnRNP G的SRGY和C-RBD結(jié)構域。
研究發(fā)現(xiàn)hnRNP G通過C-RBD結(jié)構域直接結(jié)合hnRNP A1，而cPFKFB4通過競爭性結(jié)合hnRNP G的C-RBD結(jié)構域，破壞hnRNP G-hnRNP A1復合物形成，從而增強hnRNP A1與PKM前體mRNA的結(jié)合。
PKM剪接實驗表明cPFKFB4上調(diào)增加PKM2亞型比例，下調(diào)增加PKM1亞型比例，且這一調(diào)控依賴于hnRNP G。
cPFKFB4增強胰腺癌細胞糖酵解
代謝檢測發(fā)現(xiàn)cPFKFB4顯著促進乳酸生成、葡萄糖攝取和ATP產(chǎn)生，增強胰腺癌細胞的糖酵解水平。挽救實驗證實這一效應通過hnRNP G介導。
圖2 cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌惡性進展
cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌惡性進展
體內(nèi)外實驗證實cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。動物實驗顯示cPFKFB4對腫瘤生長的促進作用可被PKM2敲低所逆轉(zhuǎn)。
研究結(jié)論與意義
該研究首次揭示了缺氧誘導的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4，通過調(diào)控hnRNP G/hnRNP A1復合物影響PKM選擇性剪接，進而重編程葡萄糖代謝促進胰腺癌進展的分子機制。
這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解缺氧微環(huán)境、葡萄糖代謝重編程與胰腺癌惡性進展之間的交叉對話提供了新視角，也為胰腺癌的診斷和治療提供了潛在的生物標志物和治療靶點。cPFKFB4作為環(huán)狀RNA編碼的新型功能蛋白，拓展了我們對非編碼RNA功能多樣性的認識，為腫瘤代謝研究開辟了新方向。
該研究發(fā)表于《Molecular Cancer》雜志，為胰腺癌的精準治療提供了新的理論基礎和實驗依據(jù)，對改善胰腺癌患者預后具有重要的臨床意義。
參考資料
[1] A novel protein cPFKFB4 encoded by hsa_circ_0065394 strengthens PKM2-mediated glucose metabolic reprogramming to facilitate pancreatic cancer progression under hypoxia
摘要：研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4強化糖酵解并驅(qū)動腫瘤惡性進展。
胰腺癌作為消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，其五年生存率始終徘徊在10%左右，被稱為"癌中之王"。這種嚴峻的預后與腫瘤特有的缺氧微環(huán)境密切相關。在胰腺癌組織中，氧分壓可低至0-5.3 mmHg，遠低于正常組織的9.3-92.7 mmHg。這種極度缺氧的狀態(tài)不僅幫助腫瘤細胞適應惡劣環(huán)境，還驅(qū)動了一系列惡性生物學行為，成為胰腺癌預后不良的獨立預測因素。
在缺氧微環(huán)境中，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一類新型閉合環(huán)狀分子，通過反向剪接形成，其生物發(fā)生和功能與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關。研究表明，缺氧能誘導腫瘤細胞產(chǎn)生多種circRNA，這些分子幫助腫瘤細胞在缺氧條件下維持生存并促進腫瘤進展。然而，在胰腺癌中，缺氧相關circRNA編碼的蛋白質(zhì)功能仍不清楚。
研究人員將目光聚焦于PFKFB4基因——一個在糖代謝中發(fā)揮關鍵作用的酶。PFKFB4作為糖酵解分流酶，在果糖-2,6-二磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化中起核心作用，滿足腫瘤細胞的能量需求和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而促進腫瘤細胞在缺氧環(huán)境中的生存?；诖耍芯繄F隊提出科學假設：源自PFKFB4基因的circRNA可能是驅(qū)動胰腺癌細胞適應缺氧微環(huán)境并持續(xù)惡性演進的關鍵分子。
為驗證這一假設，研究人員采用缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)篩選胰腺癌中缺氧響應的circRNA，通過生物信息學分析和RNA免疫沉淀研究hsa_circ_0065394的環(huán)化機制，利用qRT-PCR和原位雜交評估其在胰腺癌中的表達譜和臨床意義。雙熒光素酶報告基因檢測、質(zhì)譜分析和Western blotting鑒定出hsa_circ_0065394編碼的蛋白cPFKFB4。通過功能獲得和缺失實驗在體內(nèi)外驗證cPFKFB4的生物學功能。從機制上，通過質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、免疫熒光、PKM剪接檢測、RNA免疫沉淀、Western blotting和挽救實驗，探索cPFKFB4如何調(diào)節(jié)hnRNP G與hnRNP A1的相互作用以及PKM選擇性剪接的調(diào)控。
研究發(fā)現(xiàn)缺氧相關的hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中顯著上調(diào)，且與腫瘤大小密切相關。其生物環(huán)化由hnRNP L和Alu重復序列介導。機制上，hsa_circ_0065394通過非帽依賴機制編碼一個94個氨基酸的蛋白cPFKFB4。cPFKFB4通過特異性結(jié)合hnRNP G破壞hnRNP G-hnRNP A1復合物，促進hnRNP A1介導的PKM選擇性剪接，從而增加PKM2的表達，進而增強胰腺癌細胞的糖酵解，加速缺氧條件下胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。
圖1 由hsa_circ_0065394編碼的新型蛋白cPFKFB4通過增強PKM2介導的葡萄糖代謝重編程，促進胰腺癌在缺氧條件下的進展
關鍵技術方法
研究采用臨床樣本隊列（44對胰腺癌及癌旁組織）和腫瘤組織芯片（70例胰腺癌和58例正常組織），通過缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)（1% O2）模擬腫瘤微環(huán)境。利用RNA酶R和放線菌素D實驗驗證circRNA特性，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測IRES活性，質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用，體內(nèi)外功能實驗包括CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤等評估生物學表型，PKM剪接實驗和代謝檢測分析分子機制。
hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細胞中的鑒定與表征
研究人員首先在缺氧條件下篩選PFKFB4來源的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細胞中表達最顯著。Sanger測序證實該circRNA是由PFKFB4基因外顯子2、3、4通過頭尾剪接形成的281nt環(huán)狀RNA。
實驗證實hsa_circ_0065394對RNA酶R具有抗性，且半衰期長于線性mRNA，在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，表明其是缺氧胰腺癌細胞中豐富且穩(wěn)定表達的circRNA。
hsa_circ_0065394的生物發(fā)生機制
通過生物信息學分析，研究人員在hsa_circ_0065394側(cè)翼內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了高反向互補性的Alu重復序列（AluYc和AluSx1）。缺失突變實驗證明只有同時存在這兩個Alu元件才能顯著上調(diào)hsa_circ_0065394表達。進一步篩選發(fā)現(xiàn)hnRNP L是hsa_circ_0065394生物發(fā)生的關鍵調(diào)控因子。RNA免疫沉淀實驗證實hnRNP L結(jié)合到PFKFB4前體mRNA的特定位點，促進側(cè)翼內(nèi)含子互補重復元件的結(jié)合，從而加速hsa_circ_0065394的環(huán)化。
hsa_circ_0065394的表達特征與臨床意義
在胰腺癌細胞系中，hsa_circ_0065394表達顯著上調(diào)，尤其在PANC-1和PL45細胞中。臨床樣本分析顯示其在胰腺癌組織中明顯高表達，且與腫瘤大小顯著相關。
組織芯片和原位雜交結(jié)果進一步驗證了hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中的高表達。生存分析顯示高表達患者總生存期更差，表明其具有重要的臨床預后價值。
hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4
生物信息學預測發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394包含一個285nt的開放閱讀框（ORF）和內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）。實驗證實該circRNA可翻譯產(chǎn)生約25kDa的蛋白，命名為cPFKFB4。
雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明IRES序列具有啟動翻譯活性，且完整的IRES序列對cPFKFB4的翻譯至關重要。
cPFKFB4通過hnRNP G調(diào)控PKM選擇性剪接
質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)cPFKFB4與hnRNP G特異性相互作用。進一步實驗確定cPFKFB4結(jié)合hnRNP G的SRGY和C-RBD結(jié)構域。
研究發(fā)現(xiàn)hnRNP G通過C-RBD結(jié)構域直接結(jié)合hnRNP A1，而cPFKFB4通過競爭性結(jié)合hnRNP G的C-RBD結(jié)構域，破壞hnRNP G-hnRNP A1復合物形成，從而增強hnRNP A1與PKM前體mRNA的結(jié)合。
PKM剪接實驗表明cPFKFB4上調(diào)增加PKM2亞型比例，下調(diào)增加PKM1亞型比例，且這一調(diào)控依賴于hnRNP G。
cPFKFB4增強胰腺癌細胞糖酵解
代謝檢測發(fā)現(xiàn)cPFKFB4顯著促進乳酸生成、葡萄糖攝取和ATP產(chǎn)生，增強胰腺癌細胞的糖酵解水平。挽救實驗證實這一效應通過hnRNP G介導。
圖2 cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌惡性進展
cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌惡性進展
體內(nèi)外實驗證實cPFKFB4通過PKM2促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。動物實驗顯示cPFKFB4對腫瘤生長的促進作用可被PKM2敲低所逆轉(zhuǎn)。
研究結(jié)論與意義
該研究首次揭示了缺氧誘導的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4，通過調(diào)控hnRNP G/hnRNP A1復合物影響PKM選擇性剪接，進而重編程葡萄糖代謝促進胰腺癌進展的分子機制。
這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解缺氧微環(huán)境、葡萄糖代謝重編程與胰腺癌惡性進展之間的交叉對話提供了新視角，也為胰腺癌的診斷和治療提供了潛在的生物標志物和治療靶點。cPFKFB4作為環(huán)狀RNA編碼的新型功能蛋白，拓展了我們對非編碼RNA功能多樣性的認識，為腫瘤代謝研究開辟了新方向。
該研究發(fā)表于《Molecular Cancer》雜志，為胰腺癌的精準治療提供了新的理論基礎和實驗依據(jù)，對改善胰腺癌患者預后具有重要的臨床意義。
參考資料
[1] A novel protein cPFKFB4 encoded by hsa_circ_0065394 strengthens PKM2-mediated glucose metabolic reprogramming to facilitate pancreatic cancer progression under hypoxia
