摘要：研究揭示了TUFT1在肝星狀細(xì)胞（HSC）活化及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）中的關(guān)鍵作用。
肝臟是結(jié)直腸癌（CRC）最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官，肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因。盡管治療手段不斷進(jìn)步，但結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）患者的臨床預(yù)后仍然不佳。因此，深入理解CRCLM的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要。在肝臟腫瘤微環(huán)境中，肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟特有的周細(xì)胞，正常狀態(tài)下處于靜息狀態(tài)。然而，在CRCLM過程中，HSC被腫瘤來源的信號(hào)激活，成為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的主要來源。這些HSC來源的CAF通過沉積細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白、分泌細(xì)胞因子和生長因子，并創(chuàng)造免疫抑制性腫瘤微環(huán)境來加速腫瘤定植，從而重塑肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是肝臟腫瘤微環(huán)境中含量豐富的組分，是激活HSC為CAF的最有效因子之一。TGF-β通過激活TGF-β信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HSC活化，包括在質(zhì)膜（PM）上連接TGF-β受體II（TβRII）和TGF-β受體I（TβRI），磷酸化SMAD2/3，在細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)SMAD2/3/4復(fù)合物形成，并將SMAD復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。由于TβRII是信號(hào)級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)子，其PM定位、內(nèi)化、運(yùn)輸和降解在HSC活化中起著決定性作用。然而，TβRII結(jié)合蛋白如何調(diào)節(jié)HSC活化尚不完全清楚。
為了回答TGF-β刺激的HSC活化機(jī)制問題，研究人員開展了此項(xiàng)研究。他們通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析，在原發(fā)性人HSC和水生化LX2細(xì)胞中鑒定出TUFT1（Tuftelin 1）是一種新型的TβRII結(jié)合蛋白。機(jī)制上，TUFT1通過其氨基酸片段（a.a. 1–86, 87–157）與TβRII相互作用，競爭性地破壞caveolin-1（CAV1）與TβRII的結(jié)合，從而將TβRII從CAV1介導(dǎo)的降解途徑中解救出來，并將其分選進(jìn)入內(nèi)體介導(dǎo)的運(yùn)輸和信號(hào)通路，保護(hù)TβRII免遭溶酶體降解，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)和HSC的肌成纖維細(xì)胞活化。臨床方面，研究證實(shí)TUFT1在患者來源的CRCLM組織的CAF中表達(dá)。在HSC/CRC共植入和小鼠門靜脈腫瘤注射模型中，靶向HSC中的TUFT1可抑制HSC活化，并限制CRC在皮下和肝臟部位的生長。該研究揭示了TUFT1在肝臟腫瘤微環(huán)境中的新功能，強(qiáng)調(diào)其通過促進(jìn)TβRII蛋白穩(wěn)定性，作為HSC活化和促轉(zhuǎn)移肝微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的作用。靶向HSC中的TUFT1為對(duì)抗CRCLM提供了一種有前景的治療策略。相關(guān)研究成果發(fā)表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》期刊上。
圖1 TUFT1可穩(wěn)定TGF-β受體II蛋白，并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化為具有轉(zhuǎn)移促進(jìn)功能的肌成纖維細(xì)胞
研究人員為開展此項(xiàng)研究，運(yùn)用了幾個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)方法。他們利用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜（IP-MS）技術(shù)鑒定了TUFT1是TβRII的結(jié)合蛋白。通過構(gòu)建短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低TUFT1表達(dá)，并利用蛋白質(zhì)印跡（WB）、免疫熒光（IF）、共聚焦顯微鏡等技術(shù)，在原發(fā)性人HSC和LX2細(xì)胞系中驗(yàn)證了TUFT1對(duì)TβRII蛋白穩(wěn)定性及TGF-β信號(hào)通路的影響。研究還采用了細(xì)胞表面生物素化實(shí)驗(yàn)、溶酶體和蛋白酶體抑制劑處理、蛋白質(zhì)半衰期測定、免疫共沉淀（Co-IP）檢測蛋白質(zhì)相互作用和泛素化水平。此外，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了TGF-β/SMAD信號(hào)對(duì)TUFT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。體內(nèi)功能研究則利用了HSC/CRC細(xì)胞共植入皮下瘤模型、條件性基因敲除小鼠（TUFT1flox/floxCol1a2-CreER小鼠）以及門靜脈注射MC38細(xì)胞構(gòu)建的CRCLM模型。臨床樣本方面，研究使用了來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的18例CRC患者配對(duì)的CRCLM組織和癌旁正常肝組織分離的CAF和HSC。生物信息學(xué)分析包括對(duì)公共單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的再分析，以驗(yàn)證TUFT1在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)。
TUFT1被鑒定為HSC中TβRII的結(jié)合蛋白
研究人員通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析，在過表達(dá)TβRII-HA融合蛋白的原代人HSC中，鑒定出TUFT1是TβRII的一個(gè)新型結(jié)合蛋白。隨后的Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性TUFT1與過表達(dá)的TβRII-HA在原代人HSC和LX2細(xì)胞中發(fā)生共沉淀，反之，過表達(dá)的TUFT1-3×Flag也能沉淀內(nèi)源性TβRII。內(nèi)源性蛋白質(zhì)的Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證了TβRII與TUFT1在HSC中的相互作用。雙標(biāo)免疫熒光顯示TβRII-HA與TUFT1在HSC的質(zhì)膜和內(nèi)體中共定位。
TUFT1在患者CRCLM的活化HSC/CAF中表達(dá)
組織學(xué)分析顯示，在患者CRCLM樣本中，α-SMA（活化的HSC/CAF標(biāo)志物）與TUFT1的免疫熒光信號(hào)共定位，表明TUFT1蛋白在CAF中表達(dá)?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析公共數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在CRCLM的基質(zhì)細(xì)胞中，CAF的TUFT1轉(zhuǎn)錄本水平最高。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)，與配對(duì)的癌旁正常肝組織中的HSC相比，患者CRCLM組織中分離的CAF的TUFT1和TβRII蛋白水平均顯著上調(diào)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。
靶向TUFT1降低TβRII蛋白穩(wěn)定性并促進(jìn)其溶酶體降解
在原代人HSC和LX2細(xì)胞中敲低TUFT1后，TβRII的蛋白水平顯著降低，但TβRI蛋白水平不變。有趣的是，TUFT1敲低反而上調(diào)了TβRII的mRNA水平，提示TUFT1可能在翻譯后水平調(diào)節(jié)TβRII。蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1敲低顯著縮短了TβRII的蛋白半衰期。使用溶酶體抑制劑（Bafilomycin A1或E64d+ Pepstatin A）處理可以恢復(fù)TUFT1敲低細(xì)胞中TβRII的蛋白水平，而蛋白酶體抑制劑MG132則無此效果。免疫熒光顯示，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII-HA與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1的共定位。Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII的泛素化水平。這些結(jié)果表明，靶向TUFT1通過促進(jìn)TβRII的泛素化和溶酶體降解途徑來下調(diào)其蛋白水平。
TUFT1通過競爭CAV1結(jié)合來保護(hù)TβRII
研究發(fā)現(xiàn)，TUFT1敲低并不影響CAV1的mRNA和蛋白水平。然而，Co-IP和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII與CAV1的結(jié)合及共定位，而過表達(dá)TUFT1則抑制了這種結(jié)合。相反，敲低CAV1則增強(qiáng)了TβRII與早期內(nèi)體標(biāo)志物EEA1的共定位。這些結(jié)果說明，TUFT1通過與CAV1競爭性結(jié)合TβRII，將TβRII從脂筏/小窩介導(dǎo)的降解途徑中解救出來，轉(zhuǎn)而導(dǎo)向內(nèi)體介導(dǎo)的循環(huán)和信號(hào)通路，從而穩(wěn)定TβRII。截?cái)囿w實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1的N端氨基酸1-157片段（包含a.a. 1-86和87-157兩個(gè)區(qū)域）負(fù)責(zé)與TβRII的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且該片段足以恢復(fù)TUFT1敲低導(dǎo)致的TβRII蛋白水平下降和SMAD信號(hào)減弱。
TUFT1敲低改變HSC的TGF-β轉(zhuǎn)錄組并抑制其活化
RNA測序分析顯示，在TGF-β1刺激的HSC中，TUFT1敲低改變了1858個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，其中690個(gè)是TGF-β1誘導(dǎo)且TUFT1依賴的差異表達(dá)基因。這些基因富集在ECM組織、跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路、間充質(zhì)發(fā)育等生物學(xué)過程。TUFT1敲低抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化標(biāo)志物（如α-SMA, CTGF, Fibronectin, Collagen I）的表達(dá)以及SMAD2/3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位。條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1敲低HSC的條件培養(yǎng)基對(duì)CRC細(xì)胞（HT29, HCT116）的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的促進(jìn)作用減弱。這些效應(yīng)可通過在TUFT1敲低細(xì)胞中重新過表達(dá)TβRII-HA而部分恢復(fù)。
TGF-β1/SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)錄上調(diào)TUFT1表達(dá)
研究人員發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激可上調(diào)HSC中TUFT1的mRNA和蛋白水平。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，TGF-β1可增強(qiáng)TUFT1啟動(dòng)子的活性。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在TGF-β1刺激下，SMAD2/3蛋白可直接結(jié)合到TUFT1的啟動(dòng)子區(qū)域。這表明TUFT1本身是TGF-β/SMAD信號(hào)通路的一個(gè)轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，從而在HSC中形成了一個(gè)正反饋環(huán)路，強(qiáng)化其活化。
靶向HSC TUFT1抑制小鼠體內(nèi)CRC生長和肝轉(zhuǎn)移
在體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)中，將HT29 CRC細(xì)胞與對(duì)照HSC或TUFT1敲低HSC共植入裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)TUFT1敲低HSC對(duì)HT29腫瘤生長的促進(jìn)作用顯著減弱。腫瘤組織中CAF密度（α-SMA陽性）以及HSC來源的促腫瘤因子（如COMP, CTGF, IGFBP3, LIF）水平均降低。更重要的是，利用TUFT1flox/floxCol1a2-CreER條件性基因敲除小鼠（他莫昔芬誘導(dǎo)后特異性在HSC中敲除TUFT1），在門靜脈注射MC38 CRC細(xì)胞構(gòu)建的CRCLM模型中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照TUFT1flox/flox小鼠相比，條件性敲除小鼠的肝臟轉(zhuǎn)移瘤負(fù)荷顯著減輕，轉(zhuǎn)移瘤中CAF活化程度及相關(guān)促腫瘤因子表達(dá)也明顯下降。
圖2 TUFT1與肝星狀細(xì)胞中的TGF-β受體II（TβRII）結(jié)合
研究結(jié)論與意義
本研究首次發(fā)現(xiàn)并闡明了TUFT1在肝星狀細(xì)胞活化及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及分子機(jī)制。TUFT1作為TβRII的新型結(jié)合蛋白，通過競爭性抑制CAV1與TβRII的結(jié)合，阻止TβRII進(jìn)入脂筏/小窩介導(dǎo)的降解途徑，從而穩(wěn)定TβRII蛋白，增強(qiáng)TGF-β/SMAD信號(hào)通路，最終驅(qū)動(dòng)HSC活化為促進(jìn)轉(zhuǎn)移的CAF。此外，TUFT1本身受TGF-β/SMAD信號(hào)通路上調(diào)，形成了一個(gè)正反饋循環(huán)，持續(xù)放大HSC的活化信號(hào)。研究在細(xì)胞模型、患者組織樣本以及多種小鼠體內(nèi)模型（皮下共植入模型和門靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型）中均驗(yàn)證了靶向HSC中的TUFT1能夠有效抑制HSC活化、CAF功能以及CRC的肝轉(zhuǎn)移。
該研究的創(chuàng)新性在于揭示了TUFT1在肝臟腫瘤微環(huán)境，特別是HSC活化過程中的全新功能，并闡明了一條精細(xì)調(diào)控TβRII蛋白穩(wěn)定性和信號(hào)傳導(dǎo)的新機(jī)制（TUFT1競爭性拮抗CAV1）。這一發(fā)現(xiàn)不僅深化了對(duì)TGF-β受體 trafficking 和降解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，而且將TUFT1確立為干預(yù)HSC活化和CRCLM的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)腫瘤基質(zhì)、改善CRCLM預(yù)后的治療策略提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
參考資料
[1] TUFT1 stabilizes TGF-β receptor II protein and facilitates activation of hepatic stellate cells into metastasis-promoting myofibroblasts
摘要：研究揭示了TUFT1在肝星狀細(xì)胞（HSC）活化及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）中的關(guān)鍵作用。
肝臟是結(jié)直腸癌（CRC）最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官，肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因。盡管治療手段不斷進(jìn)步，但結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）患者的臨床預(yù)后仍然不佳。因此，深入理解CRCLM的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要。在肝臟腫瘤微環(huán)境中，肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟特有的周細(xì)胞，正常狀態(tài)下處于靜息狀態(tài)。然而，在CRCLM過程中，HSC被腫瘤來源的信號(hào)激活，成為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的主要來源。這些HSC來源的CAF通過沉積細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白、分泌細(xì)胞因子和生長因子，并創(chuàng)造免疫抑制性腫瘤微環(huán)境來加速腫瘤定植，從而重塑肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是肝臟腫瘤微環(huán)境中含量豐富的組分，是激活HSC為CAF的最有效因子之一。TGF-β通過激活TGF-β信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HSC活化，包括在質(zhì)膜（PM）上連接TGF-β受體II（TβRII）和TGF-β受體I（TβRI），磷酸化SMAD2/3，在細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)SMAD2/3/4復(fù)合物形成，并將SMAD復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。由于TβRII是信號(hào)級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)子，其PM定位、內(nèi)化、運(yùn)輸和降解在HSC活化中起著決定性作用。然而，TβRII結(jié)合蛋白如何調(diào)節(jié)HSC活化尚不完全清楚。
為了回答TGF-β刺激的HSC活化機(jī)制問題，研究人員開展了此項(xiàng)研究。他們通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析，在原發(fā)性人HSC和水生化LX2細(xì)胞中鑒定出TUFT1（Tuftelin 1）是一種新型的TβRII結(jié)合蛋白。機(jī)制上，TUFT1通過其氨基酸片段（a.a. 1–86, 87–157）與TβRII相互作用，競爭性地破壞caveolin-1（CAV1）與TβRII的結(jié)合，從而將TβRII從CAV1介導(dǎo)的降解途徑中解救出來，并將其分選進(jìn)入內(nèi)體介導(dǎo)的運(yùn)輸和信號(hào)通路，保護(hù)TβRII免遭溶酶體降解，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)和HSC的肌成纖維細(xì)胞活化。臨床方面，研究證實(shí)TUFT1在患者來源的CRCLM組織的CAF中表達(dá)。在HSC/CRC共植入和小鼠門靜脈腫瘤注射模型中，靶向HSC中的TUFT1可抑制HSC活化，并限制CRC在皮下和肝臟部位的生長。該研究揭示了TUFT1在肝臟腫瘤微環(huán)境中的新功能，強(qiáng)調(diào)其通過促進(jìn)TβRII蛋白穩(wěn)定性，作為HSC活化和促轉(zhuǎn)移肝微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的作用。靶向HSC中的TUFT1為對(duì)抗CRCLM提供了一種有前景的治療策略。相關(guān)研究成果發(fā)表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》期刊上。
圖1 TUFT1可穩(wěn)定TGF-β受體II蛋白，并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化為具有轉(zhuǎn)移促進(jìn)功能的肌成纖維細(xì)胞
研究人員為開展此項(xiàng)研究，運(yùn)用了幾個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)方法。他們利用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜（IP-MS）技術(shù)鑒定了TUFT1是TβRII的結(jié)合蛋白。通過構(gòu)建短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低TUFT1表達(dá)，并利用蛋白質(zhì)印跡（WB）、免疫熒光（IF）、共聚焦顯微鏡等技術(shù)，在原發(fā)性人HSC和LX2細(xì)胞系中驗(yàn)證了TUFT1對(duì)TβRII蛋白穩(wěn)定性及TGF-β信號(hào)通路的影響。研究還采用了細(xì)胞表面生物素化實(shí)驗(yàn)、溶酶體和蛋白酶體抑制劑處理、蛋白質(zhì)半衰期測定、免疫共沉淀（Co-IP）檢測蛋白質(zhì)相互作用和泛素化水平。此外，通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了TGF-β/SMAD信號(hào)對(duì)TUFT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。體內(nèi)功能研究則利用了HSC/CRC細(xì)胞共植入皮下瘤模型、條件性基因敲除小鼠（TUFT1flox/floxCol1a2-CreER小鼠）以及門靜脈注射MC38細(xì)胞構(gòu)建的CRCLM模型。臨床樣本方面，研究使用了來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的18例CRC患者配對(duì)的CRCLM組織和癌旁正常肝組織分離的CAF和HSC。生物信息學(xué)分析包括對(duì)公共單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的再分析，以驗(yàn)證TUFT1在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)。
TUFT1被鑒定為HSC中TβRII的結(jié)合蛋白
研究人員通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析，在過表達(dá)TβRII-HA融合蛋白的原代人HSC中，鑒定出TUFT1是TβRII的一個(gè)新型結(jié)合蛋白。隨后的Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性TUFT1與過表達(dá)的TβRII-HA在原代人HSC和LX2細(xì)胞中發(fā)生共沉淀，反之，過表達(dá)的TUFT1-3×Flag也能沉淀內(nèi)源性TβRII。內(nèi)源性蛋白質(zhì)的Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證了TβRII與TUFT1在HSC中的相互作用。雙標(biāo)免疫熒光顯示TβRII-HA與TUFT1在HSC的質(zhì)膜和內(nèi)體中共定位。
TUFT1在患者CRCLM的活化HSC/CAF中表達(dá)
組織學(xué)分析顯示，在患者CRCLM樣本中，α-SMA（活化的HSC/CAF標(biāo)志物）與TUFT1的免疫熒光信號(hào)共定位，表明TUFT1蛋白在CAF中表達(dá)?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析公共數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在CRCLM的基質(zhì)細(xì)胞中，CAF的TUFT1轉(zhuǎn)錄本水平最高。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)，與配對(duì)的癌旁正常肝組織中的HSC相比，患者CRCLM組織中分離的CAF的TUFT1和TβRII蛋白水平均顯著上調(diào)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。
靶向TUFT1降低TβRII蛋白穩(wěn)定性并促進(jìn)其溶酶體降解
在原代人HSC和LX2細(xì)胞中敲低TUFT1后，TβRII的蛋白水平顯著降低，但TβRI蛋白水平不變。有趣的是，TUFT1敲低反而上調(diào)了TβRII的mRNA水平，提示TUFT1可能在翻譯后水平調(diào)節(jié)TβRII。蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1敲低顯著縮短了TβRII的蛋白半衰期。使用溶酶體抑制劑（Bafilomycin A1或E64d+ Pepstatin A）處理可以恢復(fù)TUFT1敲低細(xì)胞中TβRII的蛋白水平，而蛋白酶體抑制劑MG132則無此效果。免疫熒光顯示，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII-HA與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1的共定位。Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII的泛素化水平。這些結(jié)果表明，靶向TUFT1通過促進(jìn)TβRII的泛素化和溶酶體降解途徑來下調(diào)其蛋白水平。
TUFT1通過競爭CAV1結(jié)合來保護(hù)TβRII
研究發(fā)現(xiàn)，TUFT1敲低并不影響CAV1的mRNA和蛋白水平。然而，Co-IP和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，TUFT1敲低增強(qiáng)了TβRII與CAV1的結(jié)合及共定位，而過表達(dá)TUFT1則抑制了這種結(jié)合。相反，敲低CAV1則增強(qiáng)了TβRII與早期內(nèi)體標(biāo)志物EEA1的共定位。這些結(jié)果說明，TUFT1通過與CAV1競爭性結(jié)合TβRII，將TβRII從脂筏/小窩介導(dǎo)的降解途徑中解救出來，轉(zhuǎn)而導(dǎo)向內(nèi)體介導(dǎo)的循環(huán)和信號(hào)通路，從而穩(wěn)定TβRII。截?cái)囿w實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1的N端氨基酸1-157片段（包含a.a. 1-86和87-157兩個(gè)區(qū)域）負(fù)責(zé)與TβRII的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且該片段足以恢復(fù)TUFT1敲低導(dǎo)致的TβRII蛋白水平下降和SMAD信號(hào)減弱。
TUFT1敲低改變HSC的TGF-β轉(zhuǎn)錄組并抑制其活化
RNA測序分析顯示，在TGF-β1刺激的HSC中，TUFT1敲低改變了1858個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，其中690個(gè)是TGF-β1誘導(dǎo)且TUFT1依賴的差異表達(dá)基因。這些基因富集在ECM組織、跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路、間充質(zhì)發(fā)育等生物學(xué)過程。TUFT1敲低抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化標(biāo)志物（如α-SMA, CTGF, Fibronectin, Collagen I）的表達(dá)以及SMAD2/3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位。條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)表明，TUFT1敲低HSC的條件培養(yǎng)基對(duì)CRC細(xì)胞（HT29, HCT116）的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的促進(jìn)作用減弱。這些效應(yīng)可通過在TUFT1敲低細(xì)胞中重新過表達(dá)TβRII-HA而部分恢復(fù)。
TGF-β1/SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)錄上調(diào)TUFT1表達(dá)
研究人員發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激可上調(diào)HSC中TUFT1的mRNA和蛋白水平。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，TGF-β1可增強(qiáng)TUFT1啟動(dòng)子的活性。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在TGF-β1刺激下，SMAD2/3蛋白可直接結(jié)合到TUFT1的啟動(dòng)子區(qū)域。這表明TUFT1本身是TGF-β/SMAD信號(hào)通路的一個(gè)轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，從而在HSC中形成了一個(gè)正反饋環(huán)路，強(qiáng)化其活化。
靶向HSC TUFT1抑制小鼠體內(nèi)CRC生長和肝轉(zhuǎn)移
在體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)中，將HT29 CRC細(xì)胞與對(duì)照HSC或TUFT1敲低HSC共植入裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)TUFT1敲低HSC對(duì)HT29腫瘤生長的促進(jìn)作用顯著減弱。腫瘤組織中CAF密度（α-SMA陽性）以及HSC來源的促腫瘤因子（如COMP, CTGF, IGFBP3, LIF）水平均降低。更重要的是，利用TUFT1flox/floxCol1a2-CreER條件性基因敲除小鼠（他莫昔芬誘導(dǎo)后特異性在HSC中敲除TUFT1），在門靜脈注射MC38 CRC細(xì)胞構(gòu)建的CRCLM模型中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照TUFT1flox/flox小鼠相比，條件性敲除小鼠的肝臟轉(zhuǎn)移瘤負(fù)荷顯著減輕，轉(zhuǎn)移瘤中CAF活化程度及相關(guān)促腫瘤因子表達(dá)也明顯下降。
圖2 TUFT1與肝星狀細(xì)胞中的TGF-β受體II（TβRII）結(jié)合
研究結(jié)論與意義
本研究首次發(fā)現(xiàn)并闡明了TUFT1在肝星狀細(xì)胞活化及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及分子機(jī)制。TUFT1作為TβRII的新型結(jié)合蛋白，通過競爭性抑制CAV1與TβRII的結(jié)合，阻止TβRII進(jìn)入脂筏/小窩介導(dǎo)的降解途徑，從而穩(wěn)定TβRII蛋白，增強(qiáng)TGF-β/SMAD信號(hào)通路，最終驅(qū)動(dòng)HSC活化為促進(jìn)轉(zhuǎn)移的CAF。此外，TUFT1本身受TGF-β/SMAD信號(hào)通路上調(diào)，形成了一個(gè)正反饋循環(huán)，持續(xù)放大HSC的活化信號(hào)。研究在細(xì)胞模型、患者組織樣本以及多種小鼠體內(nèi)模型（皮下共植入模型和門靜脈注射肝轉(zhuǎn)移模型）中均驗(yàn)證了靶向HSC中的TUFT1能夠有效抑制HSC活化、CAF功能以及CRC的肝轉(zhuǎn)移。
該研究的創(chuàng)新性在于揭示了TUFT1在肝臟腫瘤微環(huán)境，特別是HSC活化過程中的全新功能，并闡明了一條精細(xì)調(diào)控TβRII蛋白穩(wěn)定性和信號(hào)傳導(dǎo)的新機(jī)制（TUFT1競爭性拮抗CAV1）。這一發(fā)現(xiàn)不僅深化了對(duì)TGF-β受體 trafficking 和降解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，而且將TUFT1確立為干預(yù)HSC活化和CRCLM的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)腫瘤基質(zhì)、改善CRCLM預(yù)后的治療策略提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
參考資料
[1] TUFT1 stabilizes TGF-β receptor II protein and facilitates activation of hepatic stellate cells into metastasis-promoting myofibroblasts
