摘要：研究創(chuàng)新性地利用非致病性共生菌脆弱擬桿菌來(lái)源的外膜囊泡作為遞送載體，裝載抗IL-1β單鏈可變區(qū)片段（scFv），并偶聯(lián)腎臟靶向肽（KKEEE）3K，構(gòu)建了新型納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv。
慢性腎臟?。–KD）影響全球10%–15%的成年人，持續(xù)性慢性炎癥是推動(dòng)其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）在多種實(shí)驗(yàn)性和人類(lèi)腎臟疾病中扮演核心角色，然而，現(xiàn)有的抗IL-1β抗體療法面臨系統(tǒng)性副作用和生產(chǎn)成本高昂等瓶頸，限制了其在CKD治療中的應(yīng)用。外膜囊泡（OMV）是革蘭氏陰性菌天然分泌的脂質(zhì)雙層納米結(jié)構(gòu)，具有生物分子遞送和特定組織靶向能力。本研究選用非致病性共生菌脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）來(lái)源的OMV（BF-OMV）作為藥物載體，其脂多糖（LPS）內(nèi)毒素活性較低，免疫原性弱。為解決腎臟靶向難題，研究者將腎臟靶向肽（KKEEE）3K偶聯(lián)至OMV表面，并裝載更易生產(chǎn)、分子量更小的抗IL-1β單鏈可變區(qū)片段（scFv），構(gòu)建了新型納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv，旨在增強(qiáng)藥物在腎臟的富集，提高治療效率和安全性。
圖1 脆弱擬桿菌外膜囊泡遞送單鏈抗IL-1β抗體減輕慢性腎臟病腎小管炎癥
通過(guò)基因工程技術(shù)在E. coli T7表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化了分子量約為28 kDa的重組IL-1β scFv，其具有良好的中和活性和對(duì)人、鼠IL-1β的高親和力。從脆弱擬桿菌NCTC9343菌株的培養(yǎng)上清中通過(guò)超速離心法提取OMV，并通過(guò)超聲加載scFv，利用無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將（KKEEE）3K肽偶聯(lián)到OMV表面，形成OMV-(KKEEE)3K-scFv。對(duì)制備的納米顆粒進(jìn)行了形貌、粒徑、電位、載藥效率、純度、無(wú)菌及內(nèi)毒素含量等多方面的質(zhì)量控制。在體外高葡萄糖（HG）誘導(dǎo)的小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞（PTECs）炎癥模型以及鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎?。―N）小鼠模型、MRL/lpr狼瘡性腎炎（LN）小鼠模型和單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型中，系統(tǒng)評(píng)估了OMV-(KKEEE)3K-scFv的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布及其抗炎和腎臟保護(hù)功效。
OMV-(KKEEE)3K-scFv的制備與表征
成功構(gòu)建的OMV-(KKEEE)3K-scFv納米顆粒呈現(xiàn)典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑均一，穩(wěn)定性好。不同批次制備的納米顆粒在形貌、粒徑、膜電位、載藥效率（約22.6%）和（KKEEE）3K偶聯(lián)量方面具有良好的一致性。蛋白組學(xué)分析顯示不同批次OMV的蛋白組成高度相似。螯試劑（LAL）檢測(cè)表明所有制劑的內(nèi)毒素水平均低于安全閾值。
安全性評(píng)估
體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）顯示，治療劑量（8.7 × 108particles/mL）的OMV-(KKEEE)3K-scFv對(duì)PTECs的活力無(wú)影響，且未引起IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá)升高。與E. coli來(lái)源的OMV（EC-OMV）相比，BF-OMV表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性和免疫刺激性。體內(nèi)長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)（2個(gè)月）表明，健康小鼠靜脈注射OMV-(KKEEE)3K-scFv后，主要臟器（心、肝、脾、腎）病理學(xué)未見(jiàn)異常，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及炎癥細(xì)胞因子（IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4）水平均在正常范圍內(nèi)，證明了其良好的生物相容性。
組分功效驗(yàn)證
通過(guò)UUO模型驗(yàn)證了各組分功能的必要性。結(jié)果顯示，單獨(dú)的OMV、scFv、OMV-(KKEEE)3K或OMV-scFv均未能顯著改善腎臟損傷和炎癥；只有完整的OMV-(KKEEE)3K-scFv系統(tǒng)才能有效降低腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分、纖維化評(píng)分、CD68+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及腎臟MCP-1、TNF-α、IL-6的表達(dá)，證實(shí)了OMV遞送、（KKEEE）3K靶向和scFv中和功能的協(xié)同作用不可或缺。
體外抗炎功效
在高葡萄糖誘導(dǎo)的PTECs炎癥模型中，（KKEEE）3K修飾顯著增強(qiáng)了OMV的細(xì)胞攝取。OMV-(KKEEE)3K-scFv處理能顯著降低HG誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB通路關(guān)鍵蛋白磷酸化p65（p-p65）的表達(dá)，并減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌。
體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)與生物分布
體外釋放實(shí)驗(yàn)表明OMV-(KKEEE)3K-scFv能實(shí)現(xiàn)scFv的緩釋。在DN小鼠模型中，與游離scFv相比，OMV-(KKEEE)3K-scFv顯著延長(zhǎng)了scFv在血液中的循環(huán)時(shí)間，并大幅提高了scFv在腎臟組織的蓄積濃度，且在注射后48小時(shí)仍能在腎臟檢測(cè)到較高水平的scFv?；铙w成像顯示OMV-(KKEEE)3K-scFv在腎臟的熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于未修飾的OMV，且主要富集在病變側(cè)腎臟。免疫熒光染色證實(shí)scFv與腎小管細(xì)胞標(biāo)志物megalin共定位，說(shuō)明其通過(guò)megalin受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腎小管細(xì)胞。
體內(nèi)治療效果
在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中，OMV-(KKEEE)3K-scFv治療能顯著改善腎小管形態(tài)，減輕腎間質(zhì)纖維化和腎小管基底膜增厚，降低尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、腎損傷分子-1（Kim-1）水平和尿白蛋白/肌酐比值（ACR），但對(duì)血糖和體重?zé)o影響。同時(shí)，治療組腎臟CD68+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和MCP-1表達(dá)減少，TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平下降，NF-κB通路活化被抑制，血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平也顯著降低。
在LN和UUO小鼠模型中，OMV-(KKEEE)3K-scFv同樣表現(xiàn)出顯著的抗炎和腎臟保護(hù)作用，能夠減輕腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化程度，降低腎臟炎癥因子表達(dá)和血清炎癥指標(biāo)。
圖2 IL-1β單鏈抗體的制備及OMV-(KKEEE)3K-scFv融合蛋白的構(gòu)建
討論
本研究首次成功利用益生菌來(lái)源的OMV作為遞送載體，構(gòu)建了靶向腎臟的抗IL-1β納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv。該系統(tǒng)巧妙結(jié)合了BF-OMV的低免疫原性和生物相容性、（KKEEE）3K肽的腎臟靶向能力以及scFv對(duì)IL-1β的高效中和作用，實(shí)現(xiàn)了藥物在腎臟病變部位的精準(zhǔn)遞送和持續(xù)釋放。其在DN、LN、UUO三種不同病因的CKD模型中均能有效緩解腎小管炎癥和損傷，作用機(jī)制與抑制IL-1β/NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。該研究為開(kāi)發(fā)針對(duì)CKD及其他器官特異性炎癥疾病的靶向療法提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，展示了細(xì)菌OMV作為新型藥物遞送平臺(tái)的巨大應(yīng)用潛力。未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化OMV的尺寸和表面修飾，以減少非靶器官積累，并探索長(zhǎng)期給藥的免疫應(yīng)答問(wèn)題。
參考資料
[1] Single-Chain Anti-IL-1β Antibody Carried by Outer Membrane Vesicles of Bacteroides fragilis Alleviates Tubular Inflammation in Chronic Kidney Disease
摘要：研究創(chuàng)新性地利用非致病性共生菌脆弱擬桿菌來(lái)源的外膜囊泡作為遞送載體，裝載抗IL-1β單鏈可變區(qū)片段（scFv），并偶聯(lián)腎臟靶向肽（KKEEE）3K，構(gòu)建了新型納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv。
慢性腎臟?。–KD）影響全球10%–15%的成年人，持續(xù)性慢性炎癥是推動(dòng)其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）在多種實(shí)驗(yàn)性和人類(lèi)腎臟疾病中扮演核心角色，然而，現(xiàn)有的抗IL-1β抗體療法面臨系統(tǒng)性副作用和生產(chǎn)成本高昂等瓶頸，限制了其在CKD治療中的應(yīng)用。外膜囊泡（OMV）是革蘭氏陰性菌天然分泌的脂質(zhì)雙層納米結(jié)構(gòu)，具有生物分子遞送和特定組織靶向能力。本研究選用非致病性共生菌脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）來(lái)源的OMV（BF-OMV）作為藥物載體，其脂多糖（LPS）內(nèi)毒素活性較低，免疫原性弱。為解決腎臟靶向難題，研究者將腎臟靶向肽（KKEEE）3K偶聯(lián)至OMV表面，并裝載更易生產(chǎn)、分子量更小的抗IL-1β單鏈可變區(qū)片段（scFv），構(gòu)建了新型納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv，旨在增強(qiáng)藥物在腎臟的富集，提高治療效率和安全性。
圖1 脆弱擬桿菌外膜囊泡遞送單鏈抗IL-1β抗體減輕慢性腎臟病腎小管炎癥
通過(guò)基因工程技術(shù)在E. coli T7表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化了分子量約為28 kDa的重組IL-1β scFv，其具有良好的中和活性和對(duì)人、鼠IL-1β的高親和力。從脆弱擬桿菌NCTC9343菌株的培養(yǎng)上清中通過(guò)超速離心法提取OMV，并通過(guò)超聲加載scFv，利用無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將（KKEEE）3K肽偶聯(lián)到OMV表面，形成OMV-(KKEEE)3K-scFv。對(duì)制備的納米顆粒進(jìn)行了形貌、粒徑、電位、載藥效率、純度、無(wú)菌及內(nèi)毒素含量等多方面的質(zhì)量控制。在體外高葡萄糖（HG）誘導(dǎo)的小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞（PTECs）炎癥模型以及鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎病（DN）小鼠模型、MRL/lpr狼瘡性腎炎（LN）小鼠模型和單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型中，系統(tǒng)評(píng)估了OMV-(KKEEE)3K-scFv的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布及其抗炎和腎臟保護(hù)功效。
OMV-(KKEEE)3K-scFv的制備與表征
成功構(gòu)建的OMV-(KKEEE)3K-scFv納米顆粒呈現(xiàn)典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑均一，穩(wěn)定性好。不同批次制備的納米顆粒在形貌、粒徑、膜電位、載藥效率（約22.6%）和（KKEEE）3K偶聯(lián)量方面具有良好的一致性。蛋白組學(xué)分析顯示不同批次OMV的蛋白組成高度相似。螯試劑（LAL）檢測(cè)表明所有制劑的內(nèi)毒素水平均低于安全閾值。
安全性評(píng)估
體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）顯示，治療劑量（8.7 × 108particles/mL）的OMV-(KKEEE)3K-scFv對(duì)PTECs的活力無(wú)影響，且未引起IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá)升高。與E. coli來(lái)源的OMV（EC-OMV）相比，BF-OMV表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性和免疫刺激性。體內(nèi)長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)（2個(gè)月）表明，健康小鼠靜脈注射OMV-(KKEEE)3K-scFv后，主要臟器（心、肝、脾、腎）病理學(xué)未見(jiàn)異常，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及炎癥細(xì)胞因子（IL-6, TNF-α, IL-2, IL-4）水平均在正常范圍內(nèi)，證明了其良好的生物相容性。
組分功效驗(yàn)證
通過(guò)UUO模型驗(yàn)證了各組分功能的必要性。結(jié)果顯示，單獨(dú)的OMV、scFv、OMV-(KKEEE)3K或OMV-scFv均未能顯著改善腎臟損傷和炎癥；只有完整的OMV-(KKEEE)3K-scFv系統(tǒng)才能有效降低腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分、纖維化評(píng)分、CD68+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及腎臟MCP-1、TNF-α、IL-6的表達(dá)，證實(shí)了OMV遞送、（KKEEE）3K靶向和scFv中和功能的協(xié)同作用不可或缺。
體外抗炎功效
在高葡萄糖誘導(dǎo)的PTECs炎癥模型中，（KKEEE）3K修飾顯著增強(qiáng)了OMV的細(xì)胞攝取。OMV-(KKEEE)3K-scFv處理能顯著降低HG誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB通路關(guān)鍵蛋白磷酸化p65（p-p65）的表達(dá)，并減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌。
體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)與生物分布
體外釋放實(shí)驗(yàn)表明OMV-(KKEEE)3K-scFv能實(shí)現(xiàn)scFv的緩釋。在DN小鼠模型中，與游離scFv相比，OMV-(KKEEE)3K-scFv顯著延長(zhǎng)了scFv在血液中的循環(huán)時(shí)間，并大幅提高了scFv在腎臟組織的蓄積濃度，且在注射后48小時(shí)仍能在腎臟檢測(cè)到較高水平的scFv?；铙w成像顯示OMV-(KKEEE)3K-scFv在腎臟的熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于未修飾的OMV，且主要富集在病變側(cè)腎臟。免疫熒光染色證實(shí)scFv與腎小管細(xì)胞標(biāo)志物megalin共定位，說(shuō)明其通過(guò)megalin受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腎小管細(xì)胞。
體內(nèi)治療效果
在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中，OMV-(KKEEE)3K-scFv治療能顯著改善腎小管形態(tài)，減輕腎間質(zhì)纖維化和腎小管基底膜增厚，降低尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、腎損傷分子-1（Kim-1）水平和尿白蛋白/肌酐比值（ACR），但對(duì)血糖和體重?zé)o影響。同時(shí)，治療組腎臟CD68+炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和MCP-1表達(dá)減少，TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平下降，NF-κB通路活化被抑制，血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平也顯著降低。
在LN和UUO小鼠模型中，OMV-(KKEEE)3K-scFv同樣表現(xiàn)出顯著的抗炎和腎臟保護(hù)作用，能夠減輕腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化程度，降低腎臟炎癥因子表達(dá)和血清炎癥指標(biāo)。
圖2 IL-1β單鏈抗體的制備及OMV-(KKEEE)3K-scFv融合蛋白的構(gòu)建
討論
本研究首次成功利用益生菌來(lái)源的OMV作為遞送載體，構(gòu)建了靶向腎臟的抗IL-1β納米藥物OMV-(KKEEE)3K-scFv。該系統(tǒng)巧妙結(jié)合了BF-OMV的低免疫原性和生物相容性、（KKEEE）3K肽的腎臟靶向能力以及scFv對(duì)IL-1β的高效中和作用，實(shí)現(xiàn)了藥物在腎臟病變部位的精準(zhǔn)遞送和持續(xù)釋放。其在DN、LN、UUO三種不同病因的CKD模型中均能有效緩解腎小管炎癥和損傷，作用機(jī)制與抑制IL-1β/NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。該研究為開(kāi)發(fā)針對(duì)CKD及其他器官特異性炎癥疾病的靶向療法提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，展示了細(xì)菌OMV作為新型藥物遞送平臺(tái)的巨大應(yīng)用潛力。未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化OMV的尺寸和表面修飾，以減少非靶器官積累，并探索長(zhǎng)期給藥的免疫應(yīng)答問(wèn)題。
參考資料
[1] Single-Chain Anti-IL-1β Antibody Carried by Outer Membrane Vesicles of Bacteroides fragilis Alleviates Tubular Inflammation in Chronic Kidney Disease
